MAKALA BIOKIMIA II ( ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN )

ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN

I.       Hari/ Tanggal Percobaan : Senin, 02 Mei 2017

II.    Tujuan Percobaan

Mengisolasi dan memurnikan a-lactoglobulin dari susu bubuk komersial.

III.  Tinjauan Pustaka

Protein (protos yang berarti ”paling utama”) adalah senyawa organik kompleks yang mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida.  Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida(Mayes et al., 1990).

Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh(Anna, 1999).

Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein(Mayes et al., 1990).

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm(Fariz dan Siwindarto, 2014).

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari garam dengan air  (Lehninger, 1988).

Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya(Lehninger, 1988).

Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein (Anwar, 1994).

Suatu campuran protein, seperti yang dapat diekstraksi dari jaringan dengan menggunakan atau larutan garam encer, dapat dipisah-pisahkan dengan penambahan sedikit demi sedikit ammonium sulfat. Pertama-tama globulin akan diendapkan dan kemudian dapat dipisahkan dengan sentrifus atau dengan penyaringan. Albumin mengendap apabila ammonium sulfat dalam larutan tersebut telah jenuh. Pemisahan dengan menggunakan garam ini, digabungkan dengan perubahan keadaan keasaman larutan dapat memisahkan campuran protein dengan cukup baik. Pemurnian selanjutnya mungkin memerlukan prosedur kromatografi yang lebih teliti  (Anwar, 1994).

Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang(Saleh, 2004).

Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk mempercepat dalam menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium sulfat lebih sesuai untuk pemisahan analitik dari plasma protein (Saleh, 2004).

Prof. Douglas Goff, seorang dairy scientist dari University of Guelph, Kanada menyatakan, komposisi susu terdiri atas air (water), lemak susu (milk fat), dan bahan kering tanpa lemak (solids nonfat). Kemudian bahan kering tanpa lemak terbagi lagi menjadi protein, laktosa, mineral, asam (sitrat, format, asetat, laktat, oksalat), enzim (peroksidase, katalase, pospate, lipase), gas (oksigen, nitrogen), dan vitamin (vitamin A, vitamin C, vitamin D, tiamin, riboflavin). Persentase atau jumlah dari masing-masing komponen tersebut sangat bervariasi karena dipengaruhi berbagai factor seperti factor bangsa (breed) dari sapi(Anwar, 1994).

Protein dalam susu mencapai 3,25%. Struktur primer protein terdiri atas rantai polipeptida dari asam-asam amino yang disatukan ikatan-ikatan (peptide linkages). Beberapa protein spesifik menyusun protein susu. Protein pada bagian padat (disebut kasein) dan protein pada bagian cair (disebut whey). Kasein merupakan protein yang terbesar dalam susu dan sisanya berupa whey protein. Kadar kasein dalam susu mencapai 80%(Anwar, 1994).

Pemanasan, pemberian enzim proteolitik (rennin), dan pengasaman dapat memisahkan kasein dengan whey protein. Selain itu, sentrifugasi pada susu dapat pula digunakan untuk memisahkan kasein. Setelah kasein dikeluarkan, maka protein lain yang tersisa dalam protein disebut whey protein(Anwar, 1994).

Casein merupakan protein yang khas dari susu. Kasein dibuat oleh kelenjar susu. Sumber utama protein susu adalah asam amino yang terdapat dalam darah(Triyono, 2010).

Casein merupakan phosphoprotein. Casein tidak larut pada titik isoelektriknya, pH 4,6 tapi setelah pH susu mendekati 7,0, casein ada sebagai garam, Calsium Caseinate. Casein bukan protein tunggal tapi dalam bentuk grup, yang terdiri atas 3 atau lebih protein. Protein ini dinamakan α, β, κ dan λ(Triyono, 2010).

Dalam kondisi asam (pH rendah), kasein akan mengendap karena memiliki kelarutan (solubility) rendah pada kondisi asam. Kasein asam (acid casein) sangat ideal digunakan untuk kepentingan medis, nutrisi dan produk-produk farmasi. Selain sebagai makanan, acid casein digunakan pula dalam industry pelapisan kertas (paper coating), cat pabrik tekstil, perekat dan kosmetik(Triyono, 2010).

IV. Alat dan Bahan

Ø  Alat

1.      Gelas piala 100 mL

2.      Kain kasa

3.      pH meter

4.      Centrifugation

5.      Tabung centrifugation

Ø  Bahan

1.      Amonium Sulfat

2.      Aquades

3.      HCl 1,0 M

4.      NaOH 1,0 M

5.      Susu bubuk full cream komersial

V.    Metode Percobaan

Isolasi dan Pemurnian a-Lactoglobulin Susu

1.      Ditimbang 7,5 gram susu bubuk full cream dan dilarutkan menjadi 50 mL dengan air hangat (40^oC) di dalam 100 mL gelas piala.

2.      Ditambahkan perlahan-lahan sambil diaduk 10 gram garam amonium sulfat.

3.      Dibiarkan selama beberapa menit sampai terjadi pengendapan.

4.      Disaring cairan tersebut dengan kain kasa.

5.      Dituangkan filtrat ke dalam gelas piala (100 mL) dan diteteskan 1,0 M HCl secara perlahan-lahan sampai pH menjadi 3,0 (± 0,1).

6.      Dipindahkan cairan tersebut ke dalam 4 buah tabung sentrifugasi dengan volume yang sama untuk masing-masing tabung.

7.      Disentrifugasi sampai presipitat mengendap di dasar tabung (~ 15 menit).

8.      Dibuang supernatan secara perlahan-lahan.

9.      Dilarutkan kembali presipitat dalam 5 mL air dan dikumpulkan ke dalam satu tabung sentrifugasi yang bersih, kemudian naikkan pH sampai 8,5-9,0 dengan diteteskan secara perlahan-lahan 1,0 M NaOH sambal digoyang-goyangkan tabung tersebut.

10.  disentrifugasi kembali cairan tersebut dan dituangkan dengan hati-hati “supernatant” ke dalam gelas piala (50 mL).

11.  a-Lactalbumin yang relatif murni terdapat di dalam supernatan di atas.

VI. Hasil Percobaan

Percobaan 2.  ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN

Sentrifugasi I

Filtrat	pH Awal	pH Setelah Penambahan HCl
	7,4	3,35

Presipitat + Air	pH Awal	pH Setelah Penambahan NaOH
	3,35	3,8

Sentrifugasi II

VII.        Pembahasan

Pelarut yang digunakan pada percobaan ini adalah air hangat (40⁰C) untuk melarutkan susu, karena jika air yang digunakan bersuhu terlalu tinggi atau terlalu panas, maka protein dalam susu akan terdenaturasi dan menyebabkan protein dalam susu menjadi rusak. Panas dapat mengacaukan ikatan hidrogen dari protein namun tidak akan mengganggu ikatan kovalennya. Hal ini dikarenakan dengan meningkatnya suhu akan membuat energi kinetik molekul bertambah. Bertambahnya energi kinetik molekul akan mengacaukan ikatan-ikatan hidrogen. Dengan naiknya suhu, akan membuat perubahan entalpi sistem naik. Selain itu bentuk protein yang terdenaturasi dan tidak teratur juga sebagai tanda bahwa entropi bertambah. Entropi sendiri merupakan derajat ketidakteraturan, semakin tidak teratur maka entropi akan bertambah. Pemanasan juga dapat mengakibatkan kemampuan protein untuk mengikat air menurun dan menyebabkan terjadinya koagulasi. Selain itu, protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul yang bagian hidrofobik akan mengalami perubahan posisi dari dalam ke luar, begitupun sebaliknya. Hal ini akan membuat perubahan kelarutan. Kemudian pada tahap pengendapan menggunakan ammonium sulfat. Hal ini dilakukan karena protein kurang terlarut pada daerah yang konsentrasi atau kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam dibutuhkan untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein atau dengan kata lain untuk memisahkan protein dari senyawa bukan protein yang terkandung dalam larutan susu.

Sebelum disentrifugasi, perlu penambahan larutan HCl pada filtrat. Hal ini ditujukan untuk memisahkan campuran protein. Protein yang terkandung dalam susu umumnya adalah kasein dan whey protein. Kasein adalah phosphoprotein umum ditemukan di susu mamalia. Protein ini komposisinya sekitar 80% dari komposisi keseluruhan protein susu. Susu mengandung dua jenis dari protein whey dan kasein alami. Oleh karena itu susu cair murni lebih banyak mengandung protein whey dibandingkan dengan susu bubuk. Yang termasuk dalam protein whey adalah alfa-laktabumin, beta laktoglobulin, imunoglobulin, laktoferin, serum albumi, dan lisozim.

Sentrifugasi kemudian dilakukan untuk mempercepat pemisahan protein. teknik pemisahan campuran yang dilakukan dengan memanfaatkan gaya sentripetal. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Setelah proses sentrifugasi ini dihasilkan dua lapisan, dimana lapisan atas merupakan kasein dan sedangkan whey protein tidak larut pada pH < 4 sehingga whey protein terletak pada lapisan bawah. Dalam whey protein terkandung pula beberapa enzim, hormone, antibody, factor pertumbuhan (growth factor), dan pembawa zat gizi (nutrient transporter). Sebagian besar whey protein tidak tercerna secara lengkap dalam usus, maka, beberapa protein utuh dapat menstimulasi reaksi kekebalan sistemik. Peristiwa ini disebut dengan alergi protein (milk protein allergy).

Sebelum disentrifugasi untuk yang kedua kalinya, kita menambahkan NaOH pada presipitat yang telah dicampur dengan air. Hal ini ditujukan untuk memisahkan β-lactoglobulin dan α-lactalbumin yang terkandung dalam whey protein dan selanjutnya cairan tersebut disentrifugasi kembali. Setelah disentifugasi dihasilkan dua lapisan. Pada lapisan atas (supernatan) merupakan α-lactalbumin murni. α-lactalbumin ini larut pada pH > 6,0 sedangkan β-Lactoglobulin terdapat pada lapisan bawah.

VIII.     Penutup

8.1  Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bawha untuk mengisolasi dan memurnikan α-Lactalbumin dari susu bubuk komersial dapat dilakukan dengan teknik pengendapan dengan penambahan garam (salting out), penambahan asam dan penambahan basa. Sentrifugasi juga dilakukan untuk mempercepat proses pengendapan (pemisahan) protein.

8.2  Saran

Praktikan harus lebih teliti dalam melakukan praktikum agar mendapatkan hasil yang sesuai.

DAFTAR PUSTAKA

Anna, P. 1999. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press

Anwar, C. 1994. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Jakarta: Depdikbud

Fariz, A dan Siwindarto, P. 2012. Pemisahan Lemak Susu Menggunakan Metode Sentrifugasi. Jurnal Elektronika. 3(6): 12-18.

Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga

Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990. Biokimia Harper Edisi 20. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran

Saleh, E. 2004. Teknik Pengolahan Susu dan Hasil Ikutan Ternak. Jurnal Peternakan. 3(1): 16-21.

Tim Penyusun. 2017. Penuntun Praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul. Manado: FMIPA UNSRAT.

Triyono, A. 2010. Pengaruh Penambahan Beberapa Asam pada Proses Isolasi Protein Terhadap Tepung Protein Isolat Kacang Hijau (Phaseolus radiates L.). Jurnal Rekayasa Kimia dan Proses. 1(4): 11-42.